ELISA的影響因素 ELISA實驗檢測試劑盒

ELISA的影響因素 這是ELISA檢測中的重要部分，可從9個方面加以說明。
（一）固相載體：可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，如纖維素、交聯右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。由于微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合于大規模應用。國產聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠出品）目前已大量應用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質有關。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至*喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須經過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用0.2ug/ml純化的正常人IgG進行包被，經洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（O.D值）。一般認為全板中每兩孔間O.D值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應板或塑料管在使用前并不一定通過特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應用。
（二）抗原：在ELISA的影響因素 中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。經試驗證明，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的抗原。對大多數傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表面活性劑（如SDS）所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經濟，而且可以克服前帶現象。那么用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別?？乖还滔噍d體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用
PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應通過滴定。
（三）ELISA的影響因素 試驗樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關于人血清在保存過程中抗體的穩定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經用抗原或抗體包被的固相載體中進行孵育。此種被試標本可作一系列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對于作某一個傳染病的診斷來說，先用一系列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（即測定劑量反應曲線），然后用一個稀釋測定即可。zui適稀釋度和孵育時間均需從實踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的（即含抗體）作用時間一般為室溫或37℃ 1-2小時。但現在對有些標本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。
（四）結合物：在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統稱為結合物，此為進行ELISA檢測的關鍵試劑。常規使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結合物，而此種制備好的酶結合物要求穩定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產量高及成本低。
用什么樣的酶來標記抗原或抗體呢？可根據以下幾點來選擇適當的酶。
1、酶制品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數大（即一個酶分子能催化幾十幾百個底物分子發生反應的酶）。
2、酶及制備好的酶結合物在檢測或貯存中能保持穩定。
3、酶制劑易得、價廉.
4、既要適用于標記抗原，又適用于標記抗體，標記后不影響抗原或抗體的免疫學特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反應產物穩定，檢測時簡便、快速。在定量測定中產物必須是可溶性的。
6、要有安全、價廉、易得的底物。
符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105（Alkaline Phospatase,簡稱AP），辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（AP和HRP）ELISA的影響因素 zui為常用。