重細節改工藝 嚴防注射用生物制劑內毒素污染

    生物制劑包括細胞團子、重組蛋白質藥物、抗體、疫苗和寡核苷酸藥物等，其劑型多為注射劑，因此對其進行熱原控制非常關鍵。在生產過程中，表達系統、原輔材料、生產環境以及個人操作等諸多因素都可能造成產品內毒素污染。對于生物技術藥物內毒素污染的預防與去除應從兩個層面考慮：一是在生產過程中，嚴格按GMP要求進行生產，并將目標蛋白的純化與內毒素的去除結合起來；一旦產品出現內毒素污染，則要針對具體情況選擇不同措施來去除內毒素。

    ■注重生產各環節 防止內毒素污染

    在注射用生物制劑的生產過程中防止內毒素污染，涉及生產設備、過濾介質、生產器具、廠房等諸多因素。如在精制純化中，生產車間必須是符合GMP要求的潔凈廠房，各種不同的操作要在不同的潔凈區內分別進行。發酵和粗純應該在十萬級潔凈區進行，精純在萬級潔凈區域內進行，制劑、分裝須在百級間或層流罩下進行。對于任何非封閉系統的操作，均應采取無菌操作方式，如果系統自動化程度較高，可遙控操作或較少手工操作。對于任何直接接觸制品的溶液、容器、生產用具、管路、生產系統等，必須進行嚴格、有效的處理，以去除熱原。另外，用蒸餾法或反滲透法制備的新鮮注射用水或滅菌注射用水必須是無熱原的，這是清洗器具及配制溶液的基礎。

    對于玻璃器皿、不銹鋼制品等生產器具，可將其置于180℃下、3～4小時或250℃下、1～2小時干烤，以除去熱原。對于橡膠、塑料制品（如膠塞、膠管等用品），可采用0.1摩爾/升的鹽酸煮沸30分鐘，或用0.1摩爾/升的*浸泡4小時以上，急用時可煮沸30分鐘，然后用新鮮用水沖洗凈，再進行高壓滅菌。另外，對于注射型生物制劑的某些關鍵生產步驟，可采用無菌、無熱原的一次性器具，這樣既可以減少工作步驟，又可防止清洗不凈帶來污染。

    溶液的配制要使用無熱原的新鮮注射用水，整個過程必須于3小時內完成，并及時進行高壓滅菌。對于一些不能進行高壓滅菌的溶液，可通過超濾法除熱原。如磷酸鹽緩沖液在高壓滅菌時會產生具有紫外吸收的焦磷酸，這樣在使用磷酸鹽緩沖液進行柱層析時，就會對層析圖譜造成干擾，在干擾素的生產與檢定中就曾經出現過這樣的情況，對此采用超濾膜可有效地去除溶液中的熱原。

    在注射用生物制劑的生產中，對于系統、管路的清洗涉及原位清洗/原位殺菌（CIP/SIP），即主要針對泵、管道、閥門、濾器、柱、各種罐等進行定期清洗殺菌，常規要求在不拆卸任何組件的情況下原位進行。例如對于生物制劑生產中zui普遍使用的單元操作——層析，原位清洗/原位殺菌十分重要。有效的原位清洗可以減少產品污染、維持柱效和提高介質壽命。由于新一代的凝膠具有較高的物理化學穩定性，可以使用較高濃度的*進行原位清洗。對于離子交換或疏水層析介質（如CM-SepharoseFF），可使用1摩爾/升的*反向清洗一個柱床體積，如果每使用3次介質清洗1次，可使介質使用壽命達1000次；對于凝膠過濾介質（如Sephacry1等），可使用0.5摩爾/升的*清洗半個柱床體積，接觸1～2小時，如果每使用5次介質對其清洗1次，可使介質使用壽命達到800次。在白蛋白的純化流程中，對SephadexG-25C的原位清洗可采用0.5摩爾/升的*清洗0.2個柱床體積，每使用4次清洗1次，介質使用壽命可達7200次。

    ■設計純化工藝去除內毒素

    生物制劑的純化手段主要有各種柱層析技術，如疏水層析、離子交換、親和層析、分子篩等，這些技術在純化目標產品的同時還可以有效去除內毒素。如由于內毒素的脂肪A部分有很強的疏水性，但在高鹽下會凝集，無法掛上疏水層析柱，因此可選擇能結合目標蛋白的疏水層析介質來去除內毒素。

    離子交換法是通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換而達到分離純化的方法。由于內毒素在pH值＞2時帶負電荷，與陰離子交換介質Q或DEAESepharoseFastFlow有較強結合，因此可在洗脫目標蛋白后用高鹽緩沖液或*去除，這是離子交換法去除內毒素的基礎。目前美國Pharmacia公司開發出利用離子交換層析法從白蛋白中去除內毒素的工藝，其主要采用DEAE Sep-haroseFastFlow介質，將被內毒素污染的白蛋白上柱，白蛋白和大部分內毒素結合于介質上后，先清洗掉不結合的內毒素，然后選擇性洗脫白蛋白，而90％的內毒素仍結合在柱上，zui后用*將柱清洗干凈。此種方法每批可以處理20千克內毒素含量達20納克/毫升的白蛋白。

    親和層析技術特別是免疫吸附劑在生產中的運用使得生物大分子的純化變得簡單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用，以目標蛋白作為抗原，將通過雜交瘤技術生產的單克隆抗體偶聯于介質上，以此介質來吸附目標蛋白。由于相互作用的高度特異性，理論上僅有目標蛋白吸附于介質上，內毒素全部穿透，洗脫后將得到純度很高的無熱原產品。但實際上，由于介質本身存在非特異性吸附，仍有少量的雜蛋白和內毒素同時被吸附，而內毒素含量是極低的。在干擾素的生產中，洗脫物內毒素含量一般為0.25單位/毫升。

    分子篩是利用凝膠的網狀結構根據分子大小進行分離的一種方法。一般重組產品分子量為幾萬道爾頓，而內毒素分子量為幾十萬至上百萬道爾頓，常是多聚體，因此利用分子篩可以有效去除內毒素。但其處理量小，處理時間較長。

    ■采用親和層析處理內毒素污染

    即使在生產中采取了有效的工藝和嚴格的預防措施，原液仍有可能被污染。如何處理已被污染的原液是比較棘手的問題。因為原液中通常已加入保護劑，重新純化是非常困難的。如果原液及保護劑的分子量與內毒素分子量差別較大，理論上可選用適當的超濾膜來去除內毒素，但由于膜吸附過程中有產熱及系統殘留等問題，產品活性損失較大。

    目前被認為較為有效的處理方法是采用親和層析技術，將內毒素底物LAL或多糖菌素B（PMB）偶聯于CNBr-Sepharose或NHS-Sepharose上，以此為介質特異性吸附內毒素，而讓蛋白通過。國內一些企業曾使用美國Sterogene生物分離公司的ACTICLEANETOX凝膠。該產品zui大內毒素結合量為血清中2000單位/毫升膠，水中2000單位/毫升膠。一些企業使用此凝膠處理被污染的含白蛋白的干擾素，吸附量達1700單位/毫升膠，去除內毒素效果較好，但產品活性有一定損失。該產品的另一優點是化學穩定性高，可用1摩爾/升的*清洗2～14小時，但其壽命僅1年左右。

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