差分法測定谷氨酰胺的生物傳感器研制

來源： 2007年02月07日 09:40

在分離純化谷氨酸氧化酶過程中同時得到的谷氨酰胺水解酶。該酶與谷氨酸氧化酶的混合酶是制作谷氨酰胺酶膜的好材料，制得的谷氨酰胺酶膜，可在具有差分分析功能的SBA-40C型生物傳感分析儀上實現(xiàn)了谷氨酰胺的分析。
該谷氨酸-谷氨酰胺雙功能分析儀，有兩個H2O2電極，一個電極裝有復(fù)合酶膜，膜上固定著谷氨　　酰胺酶和谷氨酸氧化酶，另一個電極上固定著谷氨酸氧化酶，兩個酶膜反應(yīng)zui終產(chǎn)物H2O2由H2O2電極檢測，經(jīng)差分程序處理，測定谷氨酰胺結(jié)果可自動把樣品中本底谷氨酸值減去，從屏幕上直接顯示測得谷氨酰胺含量及本底谷氨酸含量并自動打印結(jié)果。此方法快速準(zhǔn)確，有利于自動化分析，可廣泛用于食品成分監(jiān)測、質(zhì)量檢驗及發(fā)酵在線控制及動物細(xì)胞培養(yǎng)。

　　1. 測定原理：

谷氨酰胺酶

L-谷氨酰胺 + H2O ------→ L-谷氨酸 + NH3 （1）

谷氨酸氧化酶

L-谷氨酸 + O2 + H2O ------→ α-酮戊二酸 + NH3 + H2O2 （2）

其中左電極為反應(yīng)原理（2），右電極為反應(yīng)原理（1）（2）。

　　2. 谷氨酰胺測定系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)：谷氨酰胺測定系統(tǒng)由反應(yīng)系統(tǒng)、兩支*電極和微機信號處理系統(tǒng)組成。結(jié)構(gòu)示意圖如圖1，左電極為谷氨酸酶電極，右電極為谷氨酰胺酶電極。

圖1 反應(yīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

1、有機玻璃塊 2、酶膜 3、反應(yīng)池 4、進樣針通道 5、反應(yīng)池頂帽 6、進樣帽 7、進樣傳感器 8、電極 9、電極固定螺帽 10、緩沖液排出管 11、緩沖液進入管 12、攪拌子

　　3. 測定方法

　　3.1　定標(biāo)：開機后，用100mg/100ml 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，進樣量25ml，注入反應(yīng)池后，20秒鐘后顯示打印數(shù)據(jù)，按動"定標(biāo)"鈕定標(biāo)100，對谷氨酸定標(biāo)完成；按動"功能"?"3"?"100"?"輸入"，再用10mM谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)液進樣量25ml，注入反應(yīng)池后20秒顯示打印結(jié)果，按動 "1"鍵，則對谷氨酰胺定標(biāo)完成。

　　3.2　樣品測定：定標(biāo)后，注入25ml待測樣品于反應(yīng)池中，20秒后顯示打印結(jié)果，左屏幕顯示谷氨酸含量（mg/100ml ），右屏幕顯示谷氨酰胺含量（mM）。
　　4.　儀器的穩(wěn)定性和線性
對谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/100ml ）和谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)液（10mM）連續(xù)測定20次，將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，結(jié)果表明儀器測定谷氨酰胺具有良好的穩(wěn)定性（資料略）。
用不同濃度谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)液來測定其線性，結(jié)果見表1。

　　表1、谷氨酰胺酶膜的線性試驗

谷氨酰胺	濃度（mM ）	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20
谷氨酰胺	響應(yīng)值	5	26	49	72	100	127	157	169	193	212

　　表1結(jié)果表明，谷氨酰胺酶膜在8mM-20mM濃度范圍內(nèi)，電極測定線性較好。該分析儀還設(shè)置有線性校正功能，可以對電極進行線性校正。
　　谷氨酰胺是動物細(xì)胞培養(yǎng)中很特殊的必需氨基酸，它既可作為細(xì)胞生長的主要能源，又可以作為氮源[1]。清華大學(xué)化學(xué)工程系用我們研制的谷氨酰胺分析儀，考察了儲存和培養(yǎng)條件下谷氨酰胺的化學(xué)降解，及批次培養(yǎng)條件下谷氨酰胺消耗與雜交瘤細(xì)胞生長之間的關(guān)系，得到了滿意的數(shù)據(jù)和結(jié)果，該研究已形成文章發(fā)表[2]。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　參考文獻
[1]許平，孫際賓等，谷氨酰胺的研究及開發(fā)進展，第二屆全國發(fā)酵工程學(xué)術(shù)討論會論文集，1998，235~236.
[2]辛艷，楊艷等, 谷氨酰胺在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的降解與代謝，生物工程學(xué)報，2001，17（4）：478~480.

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