細胞培養中細胞不貼壁全面分析

      大多數的哺乳動物細胞在體內和體外均附著于一定的底物而生長，在體外時這些底物可以是其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。貼壁的過程：細胞首先分泌細胞外基質，這種細胞外基質黏附在支持物的表面（培養瓶，培養皿的底面）。然后，細胞通過其表面表達的黏附因子與這些細胞外基質結合。

       一些特殊的促細胞附著物質（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴展因子等）可能參加細胞的貼附過程。這些促細胞附著因子均為蛋白質，存在于培養液尤其是血清中。在培養過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附的有促貼附物質的底物附著，以后細胞將伸展成其原來的形態。所以細胞貼壁與否和細胞本身分泌細胞外基質的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數量有關，也與培養皿壁的表面結構有關。

       細胞貼壁細胞（除腫瘤細胞外）在體外培養條件下，完成貼壁后均為單層生長，原因是貼壁細胞有接觸性抑制的特點。一般認為接觸抑制是細胞間的一種識別作用，對于動物細胞的形態形成與穩定具有重要性的作用。由于貼壁細胞的一面是緊貼在培養瓶上的，如果其上方存在細胞與其相粘附，那么下方的細胞很快就會缺乏營養餓死。

不貼壁的一些原因：

1. 胰酶消化時間把控不當：消化不夠細胞本身就是成團的；若胰酶處理太久，容易造成細胞膜蛋白損傷，使細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。

2. 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細胞的貼壁效果會下降很多。

3. 支原體或細菌的污染。

4. 培養液配制、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

5. 復蘇的細胞本身狀態不好，已經老化，失去貼附性。

6. 接種細胞數目太少，無法分泌足夠的細胞外基質。

7. 復蘇時處理速度太慢，復蘇過程不當。

如何促進細胞貼壁：

1. 適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養基打散。

2. 最好用塑料瓶培養，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養瓶，或者用鹽酸對培養瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3. 正確配制消化液或培養液。

4. 使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

5. 復蘇新的細胞，第一周用20%血清幫助細胞復原。

6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

7. 細胞傳代24小時之內，最好不要晃動，以免影響貼壁。

8. 體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上，因此培養在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。