PCR反應(yīng)各種問題解答

        聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。

PCR反應(yīng)過程常出現(xiàn)各種問題，下面對問題做詳細(xì)匯總解答：

1. 無擴(kuò)增條帶
（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。
（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不全。
（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。
（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。
（6）引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
（7）DNA凝膠電泳時(shí)加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

2. PCR產(chǎn)物量過少
（1） 退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
（2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3） PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。
（4） 引物量不足。增加體系中引物含量。
（5） 延伸時(shí)間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時(shí)間。
（6） 變性時(shí)間過長。變性時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。
（7） DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈

3. 擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高。可適當(dāng)降低其用量。
（4）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
（6）循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
（7）退火溫度過低。
（8）電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒有凝固好；
③瓊脂糖質(zhì)量差。
（9）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。
（10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

4. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶 （雜帶）
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
（5）樣品處理不當(dāng)。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。
（8）復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。
（9）反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并徹di混勻。
（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
（11）引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
（12）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。

5.陰性對照出現(xiàn)條帶
試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
6.條帶大小與理論不符
1) 污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
2) 模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板。
3) 基因亞型。對研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。