PCR反應試驗問題全面解析

聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。兩個引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補，由此限定擴增片段。PCR反應由一系列的變性→退火→延伸反復循環構成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上，經過N次循環可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經25到30次循環可擴增到106倍，足夠后續實驗展開。

常見問題分析與解決方法：

1、 無擴增條帶

1)、 酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。

2)、模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。

3)、 變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不全。

4)、反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10 min。

5)、 引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。

6)、 引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

7)、 DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

2、PCR產物量過少

1)、退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

2)、 DNA模板量太少。增加DNA模板量。

3)、 PCR循環數不足。增加反應循環數。

4)、 引物量不足。增加體系中引物含量。

5)、延伸時間太短。以1 kb/min的原則設置延伸時間。

6)、 變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。

3、擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散

1)、酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。

2)、dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

3)、 MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。

4)、 模板量過多。質粒DNA的用量應<50 ng，而基因組DNA則應<200 ng。

5)、 引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。

6)、 循環次數過多；增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。

7)、 退火溫度過低。

8)、 電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質量差。

9）、若為PCR試劑盒則可能：

①　由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；

②　試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。

10）、降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。

4、擴增產物出現多條帶(雜帶)

1)、 引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

2)、 循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。

3) 、酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

4) 、退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

5)、樣品處理不當。

6)、 Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。

7)、若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。

8)、 復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

9)、 反應緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化全并混勻。

10)、 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

11)、 引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

12)、 模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

13)、外源DNA污染。確保操作的潔凈。

5、 陰性對照出現條帶

試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。

6.、條帶大小與理論不符

1) 、污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。

2) 、模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。

3) 、基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。