由于CO2培養箱受使用環境和條件的影響較大，許多廠家在產品設計上仍保留用戶重新校準的部件，一般是在面板上設有校準和微調。無論哪種類型的產品，校準工作都應在箱內的溫度和濕度穩定之后進行。
1、溫度校準：
有的產品在出廠前已完成溫度校準工作，校準部件均安裝在箱內的控制板上，用戶不宜再作調整。對于面板上有校準微調的產品，可在接近培養溫度下(如37℃)，取一根精密溫度計置于箱內，待溫度穩定后觀察溫度計指示值，如與顯示值不跗，調整微調使其相附即可。
溫度的校準步驟：
①在培養箱內放置一個準確的玻璃管式水銀溫度計，以校準所設定溫度。同時，再放置一個準確的體溫計，以校準溫度。
②把溫度旋鈕調到所需溫度37℃。
③把溫度旋鈕調到*大。等待24小時，讓機器運行穩定。
④如果溫度還沒到37℃，再調整溫度旋鈕到37℃，然后再等待24小時，讓機器運行到穩定。
⑤當培養箱穩定在37℃后，按逆時針方向轉動溫度旋鈕，直到該溫度旋鈕的指示燈明亮為止。
⑥再小心地把溫度旋鈕順時針方向轉動，直到指示燈剛好熄滅為止。
注意:機器正常運轉期間，其溫度指示燈應保持熄滅狀態。當箱內溫度高于實際溫度時，該指示燈點亮報警。如果面板液晶顯示溫度與箱內溫度計讀數不一致，可進一步調整校準。先調整顯示器點，直到讀數與水銀溫度計的讀數相吻合，然后，等待數小時，讓機器穩定。如果還不一致，可重復上一步驟，直到機器運行到穩定狀態。
2、CO2濃度校準：
進行0校準。在CO2培養箱的氣體條件中，一般是以空氣中的CO2濃度為0點的，故在箱內充滿新鮮空氣時的顯示值應為0。校準時先斷開氣源，打開箱門數分鐘后再關閉，待溫、濕度穩定后兩整調0微調使顯示值為0。
CO2濃度校準一般采用氣體分析法和標準氣體法兩種方法。前者是通過面板上的氣體采樣孔采取箱內氣體樣品，經分析獲得CO2實際濃度，再校正顯示值;后者是將已知CO2濃度的標準氣體充人箱內，再校正顯示值。
對比之下，氣體分析法成本較低，但需具備氣體分析條件;標準氣體法較為方便，但購買標準氣價格較貴。校準時應注意，0點校準與濃度枝準相互有影響，所以這兩項校準應反復進行至少三次。
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